核酸外切酶III（Exonuclease III）来源于E.coli的Exo III基因，能(néng)作(zuò)用(yòng)于dsDNA，沿3´-OH 末端逐步释放5‘-单磷酸核苷酸，产(chǎn)生ssDNA片段，但对ssDNA、硫代磷酸酯连接的核苷酸无活性。

Exo III的最佳底物(wù)是平末端或3'-末端凹陷的dsDNA，但也可(kě)以将dsDNA上的Nicks外切成Gaps。3'-突出末端的dsDNA能(néng)阻止Exo III降解，其抵制程度取决于3'-突出末端的突出長(cháng)度，突出4个或更長(cháng)的碱基时能(néng)够完全阻止Exo III的酶切。另外，Exo III还具(jù)3'-磷酸酶活性、RNase H活性和AP-内切核酸酶活性。

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